Transcriptome Sequencing

特長

遺伝子発現レベルとスプライシングパターンの両方の解析を実施。
生体内の遺伝子発現変動を網羅的に解析でき、サンプル特異的な遺伝子発現パターンの同定が可能。
パスウェイ解析やGO解析を組み合わせることで、さらに実用的な結果をご提供。
がんの原因となる融合遺伝子の探索も可能。

解析概要

次世代シーケンサー（NGS）により全転写物の塩基配列を決定します。得られたリード配列を参照配列にマッピングし、転写物のアセンブリング、発現レベルの算出、転写物へのアノテーション付与を行います。複数サンプルの場合にはサンプル間での発現レベルを比較します。また、解析目的やRNAの品質に合わせて、適切な方法をお選びいただけます。

1

Total RNAの品質評価
2

必要に応じてRNA精製後、断片化 / cDNA合成
3

ライブラリ作製
4

NGSを用いたシーケンシング
5

バイオインフォマティクス解析（発現レベルの算出など）

ライブラリ作製方法

No	ライブラリ作製キット	RNA精製方法	FFPE由来RNA対応	特徴
1	TruSeq Stranded mRNA Library Prep	poly A RNA 精製	×	・最もスタンダードな方法・分解の見られるRNAは適さない
2	TruSeq RNA Exome^※	－	〇	・ヒト遺伝子（21,415）のコーディング領域のみを濃縮して解析。・分解の見られるRNAでも解析可能。
3	TruSeq Stranded Total RNA Library Prep	rRNA除去	〇	・polyAを持たないタイプのnon-coding RNAもシーケンス可能。・分解の見られるRNAでも解析可能。

※ ヒトのみ対応可能

オプションバイオインフォマティクス解析

Fusion Gene Analysis / 融合遺伝子探索（ヒトのみ対応可能）

ペアエンドリード配列を用いて、融合遺伝子を探索します。
2種類のソフトウェア（deFuse、FusionHunter）を併用することで、融合遺伝子の検出力を向上させています。

階層型クラスタリング＋ヒートマップ作成

ご指定いただいた遺伝子リストを基に、階層型クラスタリングの実施とヒートマップの作図を行います。またヒートマップの並び順に対応したExcelファイルも合わせて出力します。

パスウェイ解析（ヒト・マウス・ラットのみ対応可能）

iPathwayGuide (Advaita Bioinformatics社)を用いて実施します。
最新のKEGGデータベースを基にパスウェイ解析を行います。
over-representation analysisと、上流の遺伝子からの影響度を全遺伝子について計算し有意なパスウェイを抽出する独自の解析手法により、高精度な解析結果が得られます。

解析結果

リード配列を参照配列に対してスプライシングを考慮してマッピング^※1し、ジャンクション構造予測※1を行います。その後、転写物のアセンブリング^※1、発現レベルの比較を行います。発現レベルの比較は、geneレベルやisoformレベルで実施し、各種アノテーション^※2をつけてエクセル・マクロファイルとテキストファイル^※3でご提出します。

※1 マッピング結果、ジャンクション構造予測結果、転写物のアセンブル結果はIntegrative Genomics Viewer（IGV）で閲覧することが可能です。
※2 発現レベル比較データには次のようなアノテーションがつきます（Humanの場合）。遺伝子名、ゲノム上の位置、Entrez Gene ID、RefSeq ID、GO ID、KEGG ID、OMIM ID、Pfam IDなど
※3 アノテーションは弊社オリジナルのエクセル・マクロ（AnnotationViewer）で観覧でき、IGVおよび外部データベースと連携するようになっています。

納品物

解析報告書
データHDD：リード情報（FASTQ）、マッピングデータ（BAM）、ジャンクション構造予測データ（BED）、転写物データ（GTF）、発現レベル比較データ（エクセル・マクロファイルとテキストファイル）、GO解析データ（テキストファイル）

サンプル条件

ライブラリ作製キット	TruSeq Stranded mRNA Library Prep、 TruSeq Stranded Total RNA Library Prep	TruSeq RNA Exome
サンプルの種類	精製Total RNA	精製Total RNA
RNA 量	3 µg	0.5 μg
濃度^※1	65 ng/μL 以上	20 ng/μL 以上
RIN値^※2	7 以上	-^※3

※1 サンプルの定量はAgilent 2100バイオアナライザまたはAgilent 2200 TapeStationを用いた方法を推奨しております。
※2 サンプルの（バイオアナライザによる）電気泳動図がお手元にある場合にはご提供をお願いします。
※3 200 nt以上のRNA断片が50%以上（DV200?50％）の品質を推奨しています。

解析例

ライブラリ作製キット	TruSeq Stranded mRNA Library Prep
機種	NovaSeq 6000
平均データ量/サンプル	約 40M リード以上
シーケンス方法	Paired End / Multiplex
バイオインフォマティクス解析	スプライシングパターン予測、正規化された発現レベルの算出、発現レベルのサンプル間比較、GO解析
納期	品質評価通過後、約2.5ヵ月^※

※ 同時に解析を行うサンプル数が多い場合には、別途お打ち合わせの上決定いたします。

バイオインフォマティクス解析対応生物種

ヒト、マウス、ラット、チンパンジー、アカゲザル、ウシ、ブタ、イヌ、ニワトリ、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、線虫、シロイヌナズナ、出芽酵母、他30種

ヒト、マウス、ラットはK-meansクラスタリングおよびGO解析に対応しています。