現在、合成遺伝子は PCR ベースのクローニングに代わり、ますます利用されるようになっています。 Twist Bioscience 社は独自の DNA 合成プラットフォームによって、遺伝子合成のスループットとスケーラビリティを大きく向上させました。また、合成の正確性が高い本技術により業界でもトップクラスのエラー率の低さを実現、1塩基あたりのコストも低減することで、よりお客様の研究を加速させます。

技術

Twist Bioscience社は、従来の96ウェルプレートと同じサイズの100万個のナノウェルを有するシリコンウエハーを用いた独自のDNA合成プラットフォームを開発しました。各ナノウェル一つ一つで長さの異なる数百塩基のオリゴDNA配列を合成し、 121個のナノウェルを単位とするクラスターでアッセンブリ反応を行い、オリゴDNA配列をつなぎ合わせることによって、このシリコンウエハー上で一度に9,600の遺伝子断片を合成できます。少ない反応液量で多量の遺伝子を合成できる本技術により、高効率・低価格を実現しました。

二本鎖 DNA 断片の合成サービス - Gene Fragments-

業界トップクラスの価格

・300 ~ 5000 bp まで対応、価格は\ 19 /bp ~
　＊ご発注金額に応じて、別途送料がかかる場合がございます。詳細はお見積の際にご案内いたします。
・ご注文後約2週間でのお届け
　＊注文数に制限はありません

正確な断片合成技術でお客様の研究を迅速化

・合成量：100 ng ~ 1.0 µg / 断片
・平均エラー率：1/3,000 bp
・適合するクローニング法：制限酵素クローニング, Gateway® クローニング, Golden Gate クローニング, TOPO® クローニング

		Gene Fragments
合成プラン		アダプターあり・なし
費用	300 ~ 500 bp	￥9,500 /本
	501 ~ 3,200 bp	￥19 /bp
	3,201 ~ 5,000 bp	￥25 /bp
合成可能配列長		300 ～ 5,000 bp
納期		メーカー受注後、最短 4営業日で米国工場を出荷*1
オプション	無料	① 容器：4種から選択（2.0 mLチューブ，96well PCRプレート，96wellプレート，384well echo プレート） ② ご依頼配列のコドン最適化 ③ 溶液状態での納品*2 ④ 最終製品の濃度調整 (250 ng /fragment)
納品形態		乾燥 DNA*3,4
備考		アダプター 5’ – CAATCCGCCCTCACTACAACCG – insert – CTACTCTGGCGTCGATGAGGG

*1 受注後の合成のため、納期遅延や合成段階での中断・中止の可能性がございます
*2 2.0mL チューブ以外の納品容器でのご依頼の場合のみ可能です
*3 「Gene_DNA Resuspension, Dilution, and Storage Guidelines」に従って懸濁し使用してください (ヌクレアーゼフリーのTEなど)
*4 常温で3ヶ月, 4℃で1年間, -20℃で2年間, -80℃であれば長期保管可能

DNA 断片に付加されるアダプター配列

[Gene Fragmentsサービスの「アダプターあり」のプランではご依頼頂いた二本鎖 DNA 断片に、DNA 合成に必要な下記のアダプター配列が付加された状態でのご提供となります。

アダプターあり	アダプターなし
・Twistアダプター配列をもとにプライマーをご用意いただくことにより、遺伝子断片の増幅をプライマー1セットで行うことが可能です。 ・Twistアダプター配列はプライマー配列としても適切に設計されており、良好な増幅性能を発揮するため、お客様ご自身でプライマーを設計する必要がありません。 ・より高いスループットを求めるお客様にとって便利です。	・平滑末端クローニングやTOPOクローニングなどのクローニング手法を用いる際に便利です。 ・アダプター無しの遺伝子断片を使用することで、インサートは追加のアダプターなしでベクターにクローニングされます。

ガイドラインを参考に、合成する配列の設計をお願いいたします。 また、アダプター配列に関しては使用目的に応じて制限酵素サイトを付加した形での設計や、PCRをご活用ください。

General Guidelines Cloning Guidelines

遺伝子合成およびクローニングサービス - Clonal Genes -

合成した配列を Twist ベクターにクローニング致します。 クローニングする配列は、NGS によって事前に検証を行います。

業界トップの価格

・ 300 ~ 5,000 bp まで対応、価格は\ 26 /bp ~
　＊ご発注金額に応じて、別途送料がかかる場合がございます。詳細はお見積の際にご案内いたします。
・米国工場を最短11営業日で出荷 (注文数量による納期の変更はありません)
・1 クローンからオーダー可能
・通常合成量：1~4 µg

		Clonal Genes
合成プラン		Twist ベクター (8種類)	Expression ベクター (15種類)	Custom ベクター
合成費用	300 ~ 500 bp	\ 22,000 /本 （クローニング費用込）	\ 27,500 /本 （クローニング費用込）	\ 33,000 /本 （クローニング費用込）
	501 ~ 1,800 bp	\ 26 /bp
	1,801 ~ 3,200 bp	\ 36 /bp
	3,201 ~ 5,000 bp	\ 48 /bp
クローニング費用 （300～500 bpの場合は不要 ）		\ 9,000 /本	\ 14,500 /本	\ 20,000 /本
その他 費用		-	-	ベクター登録費用：￥110,000 挿入領域 2ヶ所目以降：￥55,000
納期		メーカー受注後、最短 11営業日で米国工場を出荷*1		別途お打合せ
オプション	無料	① 容器：4種から選択（2.0 mLチューブ，96well PCRプレート，96wellプレート，384well echo プレート）*2 ② ご依頼配列のコドン最適化
	有料	① スケールアップ：通常1-4µg、有料で3スケールより選択可能 (4~10µg, 10~100µg, 100µg~1.0mg) ② 最終製品の濃度調整 (0.5~1.0mg /mLの範囲より選択 / 溶解Bufferの選択可能) ③ エンドトキシンフリー (< 0.1EU /µg) ④動物由来成分フリー
納品形態		乾燥 DNA*3,4

*1 受注後の合成のため、納期遅延や合成段階での中断・中止の可能性がございます
*2 有料オプションのスケールアップで【10µg以上】をご依頼の場合は次の4種から選択となります
　　(2.0mL チューブ, 96 deep well プレート, 1.4mL Micronicチューブ, 4.0mL Micronicチューブ)
*3 「Gene_DNA Resuspension, Dilution, and Storage Guidelines」に従って懸濁し使用してください (ヌクレアーゼフリーのTEなど)
*4 常温で3ヶ月, 4℃で1年間, -20℃で2年間, -80℃であれば長期保管可能

お客様のニーズに応える様々なオプション

・合成 DNA 量, ベクター, 溶解 Buffer, グリセロールストック添加など用途に応じた幅広いニーズに対応

オプション		価格
溶解Buffer 選択*1,2		\ 0
DNA 合成量	4 ~ 10 µg	+ \ 3,000 /本 ~
	10 ~ 100 µg ( < 10 EU/µg )	+ \ 30,000 /本 ~
	0.1 ~ 1 mg ( < 10 EU/µg )	+ \ 40,000 /本 ~
動物由来成分フリー（AOF）		+ \ 15,000 /本 ~
エンドトキシンフリー*2 ( < 0.1 EU/µg )		+ \ 15,000 /本 ~
DNA 濃度調整*2		+ \ 5,000 /本 ~

*1 10 µg 以上の合成をご依頼頂いた場合のみに適用可能です。
*2 濃度調整を行う場合は下記の溶解Buffer からお選びください。
　・精製水
　・Elution buffer(2mM Tris-Cl, pH 8.5)
　・TE buffer (10mM Tris-Cl, pH 8.0, 1mM EDTA)
　・TE buffer low EDTA (10mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.1mM EDTA)

Clonal Genes で利用される Twist ベクター

Twist 社では、お客様の様々な実験ニーズに応えるべく、様々なベクターを準備しております。

ベクター一覧

Twist Vector

1. Twist クローニングベクター

高コピー数ベクター
これらのベクターには pMB1 複製開始点が含まれます。挿入部位に隣接する F (順方向) および R (逆方向) プライマーは増幅を容易にし、遺伝子のシーケンスを可能にする M13 F および R プライマー結合部位も含まれています。

・Amp High Copy
_{アンピシリン耐性マーカー}

・Kan High Copy
_{カナマイシン耐性マーカー}

・Chlor High Copy
_{クロラムフェニコール耐性マーカー}

中コピー数ベクター
これらのベクターは p15A 複製開始点が特徴です。挿入部位に隣接する F (順方向) および R (逆方向) プライマーは増幅を容易にし、遺伝子のシーケンスを可能にする M13 F および R プライマー結合部位も含まれています。

・Amp Medium Copy
_{アンピシリン耐性マーカー}

・Kan Medium Copy
_{カナマイシン耐性マーカー}

・Chlor Medium Copy
_{クロラムフェニコール耐性マーカー}

ENTR
これらのベクターを使用すると、Gateway® クローニングテクノロジーを使用したすべてのタンパク質発現系に 1 つまたは複数の遺伝子を迅速にクローニングできます。エントリークローンを作成後は、目的の遺伝子を Gateway テクノロジーの使用に対応したさまざまな発現ベクターに組み換えることができます。遺伝子合成産物は attL1 と attL2 の組み換え部位の間にクローニングされます。すべての pTwist ENTR ベクターには高プラスミド収量のための pMB1 複製開始点および遺伝子のシーケンスを可能にする M13 F および R プライマー結合部位が含まれています。

・ENTR

・ENTR Kozak
_{哺乳類発現系での高発現用
　ほとんどの Gateway 哺乳類発言ベクターでN末およびC末融合タグが機能するように、クローニングサイトは適切なリーディングフレームで設計されています}

2. Twist 発現ベクター

- 哺乳類細胞発現

CMV
これらのヒトサイトメガロウイルス(CMV) プロモーター発現ベクターには、大腸菌での増殖と維持のためにアンピシリン耐性カセットが含まれており、哺乳類細胞での一過性の高レベル発現用に設計されています。転写終結は、マルチクローニングサイトの 3‘ 側の SV40 ポリ A シグナルによって行われます。ベクターの選択肢には、哺乳類用の選択マーカーも含まれており、それ以外に発現レベルを高めるオプションも提供しています。

・CMV

・CMV Beta Globin
_{β グロブリンイントロンが導入遺伝子発現を増強}

・CMV OriP
_{OriP が EBNA で形質転換された HEK-293 細胞でのタンパク質発現レベルを亢進}

・CMV Hygro
_{哺乳類細胞選択用のハイグロマイシン}

・CMV Puro
_{哺乳類細胞選択用のピューロマイシン}

・MV BetaGlobin WPRE Neo
_{βグロブリンイントロンが導入遺伝子発現を増強WPRE配列が導入遺伝子発現を増強
　哺乳類細胞選択用のG418/ネオマイシン}

EF1 Alpha
これらのベクターは、ヒト伸長因子 α (EF1Alpha) プロモーターによって発現される中レベルの一過性哺乳類細胞発現を提供します。 アンピシリン耐性カセットにより、大腸菌でのベクター増殖と維持が可能です。 転写終結は、マルチクローニングサイトの 3’ 側の SV40 ポリ A シグナルによって行われます。

・EF1 Alpha

・EF1 Alpha Puro
_{哺乳類細胞選択用のピューロマイシン}

- 細菌発現

pET
これらの T7 RNA ポリメラーゼ転写ベクターは、大腸菌での発現が可能です。リボソーム結合部位と ATG 開始コドンがないため、クローン化 DNA 内の翻訳シグナルからタンパク質が発現するように設計されています。このベクターには大腸菌での転写を抑制する lac リプレッサー / lac オペレーターが含まれており、ラクトースまたはイソプロピル - β - D - チオガラクトピラノシド (IPTG) によって発現を誘導できます。一本鎖 DNA を含むウイルス粒子の産生は、ヘルパーファージとのコトランスフェクション時のコーディング鎖に対応します。

・pET-21 (+)
_{C 末 His・Tag^®配列
　アンピシリン耐性遺伝子}

・pET-24 (+)
_{C 末 His・Tag^®配列}

・pET-28a (+)
_{N 末およびオプションで C 末 His・Tag^®配列
　内部 T7・Tag^®配列
　トロンビン切断部位
　カナマイシン耐性遺伝子}

・pET-29b (+)
_{N 末 S・Tag^®配列
　C 末 His・Tag^®配列
　トロンビン切断部位
　カナマイシン耐性遺伝子}

- ウイルス発現

Lenti SFFV
レンチウイルス発現プラスミドは、分裂細胞および非分裂細胞の両方に遺伝子を安定して組み込むために使用できます。このプラスミドは、広く使用されている pCCL レンチウイルスを骨格にしています。SFFV プロモーターは導入遺伝子の発現のために存在します。この第 3 世代のレンチウイルスは、第 2 世代または第 3 世代のパッケージングミックスを使用してパッケージングできます。これらのベクターには、大腸菌での増殖と維持のためにアンピシリン耐性カセットが含まれています。

・Lenti SFFV

・Lenti SFFV Puro WPRE
_{EMCV IRESを介したSSFVプロモーターで発現する哺乳類細胞選択用の抗生物質ピューロマイシンをコードする遺伝子が含まれています
　WPRE配列が遺伝子発現を増強}

納品物・保管方法

1) 納品物
　乾燥 DNA 、あるいは 懸濁済み DNA 溶液* (お客様の指定容器での納品)
_{*Gene Fragments(アダプターなし) や Clonal Genesにてオプションでご指定頂いた場合のみ}

2) 保管手順
届き次第、チューブ(あるいはプレート) を遠心した後、任意の濃度になるようヌクレアーゼフリーの【Tris-EDTA(TE) buffer(pH8.0)】か【10 mM Tris-HCl (pH 8.0)】にて懸濁してください_{*1,2,3。
*1 精製水への懸濁は推奨しません。
*2 DNA ストックの濃度は最低 10 ng/µL を推奨します (お客様のアプリケーションに応じて調製ください)。
*3 コンタミネーションや度々の解凍結を避けるため、作業用ストックを準備してご使用ください。}

DNA Resuspension, Dilution, and Storage Guidelines

3) 保管温度
　保管期間に応じて下記の通り保存ください。
　・１年以内：-20℃
　・それ以上：-80℃

ご依頼方法

下記のGene依頼書*1,2に必要事項を記入し、当社ライフサイエンスグループまでご連絡ください。
_{*1「合成依頼書・配列入力」の2枚のシートがございます。
*2　お見積依頼時に配列情報が確定していなければ、配列長のみご連絡頂ければ概算にて価格のご案内は可能ですのでお気軽にお問い合わせください。}

Gene依頼書フォーマット

問い合わせ先

アズワン株式会社　ソリューション・デザイン部　ライフサイエンスグループ
TEL: 06-6447-8930　FAX: 06-6447-8939
Mail: [email protected]

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