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食品微生物検査の手順
(大腸菌群・大腸菌)

デソキシコレート寒天培地(大腸菌群)

手順1

各希釈段階につき2枚のシャーレに、調製した検体液1mlずつ注入します。
検体液注入のイメージ

手順2

45~50℃に保温しておいたデソキシコレート寒天培地を約15~20ml各シャーレに分注し、検体液と混合させます。
培地表面での拡散集落を防ぐため、及び大腸菌群が定型的な集落を形成するように、寒天が固まってから、さらに培地を薄く重層します。
45~50℃で保温
混ぜ合わせ方

8の字に円を描く。シャーレをまわす。

手順3

シャーレを倒置して、インキュベーターに入れ、35±1℃で20±2時間培養します。
シャーレの倒置、35±1℃で20±2時間培養
ピンク~赤色に着色の(中心部分のみ赤色も含む)集落を大腸菌群とします。
一般生菌数と同じように計測します。

手順4

EMB寒天培地上に生育した集落を確認し、金属光沢のある黒色コロニーが認められた場合「大腸菌群確定試験陽性」として完全試験を行います。
BGLB液体培地で検査を行った場合は、陽性試験管の数よりMPN値を求めます。
集落の生育が認められない場合や、定型的集落が認められない場合は、大腸菌群陰性とします。
EMB寒天培地
釣菌、採取、培養のイメージ

①デソキシコレート寒天での平板上の定型的集落を釣菌します。
②BGLBブイヨンでの推定試験でガス発生陽性試験管を1白金耳量採取します。
③EMB寒天培地に画線塗抹し、35±1℃、24±2時間培養します。

手順5

定型的集落を標準寒天斜面培地に接種し、35±1℃ 24±2時間まで培養します。
発育したコロニーをグラム染色し、検鏡します。
グラム染色、検鏡イメージ
発育した集落をグラム染色・検鏡し、グラム陰性・無芽胞桿菌⇒大腸菌群陽性

BGLB液体培地(大腸菌群)

手順1

検体液(10倍希釈液)を10ml、倍濃度のBGLBブイヨン3本に接種します。
同じく検体液を1ml、100倍段階希釈液を1ml、通常濃度のBGLBブイヨン3本に接種します。
接種のイメージ

手順2

35±1℃のインキュベーターで24~48±3時間培養します。

手順3

ダーラム管中のガス発生の有無を確認します(ガス発生が見られない場合は、試験管を軽く振って再度確認します)。
48時間まで培養しても、ガスの発生が認められなければ「大腸菌群陰性」とします(検査終了)。
培養開始後24時間でガス発生を確認し、ガス発生があれば「推定試験陽性」とし、次の試験に進みます。
ガス発生イメージ

手順4

EMB寒天培地上に生育した集落を確認し、金属光沢のある黒色コロニーが認められた場合「大腸菌群確定試験陽性」として完全試験を行います。
BGLB液体培地で検査を行った場合は、陽性試験管の数よりMPN値を求めます。
集落の生育が認められない場合や、定型的集落が認められない場合は、大腸菌群陰性とします。
EMB寒天培地
釣菌、採取、培養イメージ

①デソキシコレート寒天での平板上の定型的集落を釣菌します。
②BGLBブイヨンでの推定試験でガス発生陽性試験管を1白金耳量採取します。
③EMB寒天培地に画線塗抹し、35±1℃、24±2時間培養します。

手順5

定型的集落を乳糖ブイヨン発酵管に接種し、35±1℃ 24~48±3時間まで培養します。
接種、培養のイメージ
ガス産生が認められる⇒大腸菌群陽性

EC液体培地(糞便系大腸菌群および大腸菌)/MPN法

手順1

検体液(10倍希釈液)を10ml、倍濃度のECブイヨン3本に接種します。
同じく検体液を1ml、100倍段階希釈液を1ml、通常濃度のECブイヨン3本に接種します。
検体液(10倍希釈液)を10ml倍濃度のECブイヨン3本に接種、同じく検体液を1ml、100倍段階希釈液を1ml、通常濃度のECブイヨン3本に接種

手順2

44.5±0.2℃の恒温水槽で24±2時間培養します。

手順3

ダーラム管中のガス発生の有無を確認します(ガス発生が見られない場合は、試験管を軽く振って再度確認します)。
24時間まで培養しても、ガスの発生が認められなければ「糞便系大腸菌群陰性」とします(検査終了)。
培養開始後24時間でガス発生を確認し、ガス発生があれば「推定試験陽性」とし、次の試験に進みます。
ガス発生イメージ

手順4

採取、培養のイメージ
①ECブイヨンでの推定試験でガス発生陽性試験管から1白金耳量採取します。
②EMB寒天培地に画線塗抹し、35±1℃、24±2時間培養します。
EMB寒天培地
平板上に生育した集落を確認し、金属光沢のある黒色コロニーが認められた場合「糞便系大腸菌群確定試験陽性」として完全試験を行います。
陽性試験管の数より糞便系大腸菌群MPN値を求めます。
集落の生育が認められない場合や、定型的集落が認められない場合は「糞便系大腸菌群確定試験陰性」とします。

手順5

【IMVIC反応】以下のような結果の得られた試験管より大腸菌(E.coli)MPN値を求めます。
SIM培地【インド-ル産生(+)】、ブドウ糖リン酸ペプトン水【メチルレッド反応(+)、VP反応(-)】、シモンズクエン酸培地【クエン酸塩利用性(-)】

合成酵素基質培地

合成酵素基質培地は、従来の確定試験、完全試験の必要がないため大腸菌群の簡易・迅速検査に有効な方法です。

手順1

各希釈段階につき2枚のシャーレに、調整した検体液1mlずつ注入します。
検体液注入のイメージ

手順2

45~50℃に保温したクロモカルトコリフォーム寒天培地を約15~20ml各シャーレに分注し、検体液と混合させます。
45~50℃に保温したクロモカルトコリフォーム寒天培地を約15~20ml各シャーレに分注、混ぜ合わせ

手順3

シャーレを倒置して、インキュベーターに入れ、35~37℃で24時間培養します。
倒置、35~37℃で24時間培養のイメージ
培地に発育したコロニー
培地に発育したコロニーを計測し、一般生菌数と同じように計測します。 【大腸菌群・E.coli】
合成酵素基質培地
(クロモカルトコリフォーム寒天)
青/E.coli
赤/E.coli以外の大腸菌群

大腸菌群検査のための培地選定

検査項目 食品別 使用培地
大腸菌群 アイスクリーム類 デソキシコレート寒天培地
はっ酵乳、乳酸菌飲料 デソキシコレート寒天培地
バター、バターオイル、
プロセスチーズ、濃縮ホエイ
デソキシコレート寒天培地
上記以外の乳・乳製品 BGLB培地
氷雪、清涼飲料水、
粉末清涼飲料
LB培地
氷菓 デソキシコレート寒天培地
食肉製品(包装後加熱)、
鯨肉製品、魚肉ねり製品
BGLB培地
冷凍ゆでたこ、
生食用冷凍鮮魚介
デソキシコレート寒天培地
冷凍食品(無加熱、
凍結前加熱済み:加熱後摂取)
デソキシコレート寒天培地